實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）也稱 QPCR，是指在DNA 擴(kuò)增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)測(cè)單次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀主要由樣品載臺(tái)、基因擴(kuò)增熱循環(huán)組件、微量熒光檢測(cè)光學(xué)系統(tǒng)、微電路控制系統(tǒng)、計(jì)算機(jī)及應(yīng)用軟件組成。其中基因擴(kuò)增熱循環(huán)組件工作原理與傳統(tǒng)基因擴(kuò)增儀大致相同，不同廠家不同型號(hào)的產(chǎn)品分別采用空氣加熱、壓縮機(jī)制冷、半導(dǎo)體加熱制冷等工作方式。微量熒光檢測(cè)系統(tǒng)由熒光激發(fā)光學(xué)部件、微量熒光檢測(cè)部件、光路、控制系統(tǒng)組成。
常用的熒光激發(fā)方式有兩種：鹵鎢燈和LED；熒光檢測(cè)元件常用兩種方式：光電倍增管和冷光CCD攝像機(jī)，光單色元件有濾光片和光柵。在實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增過(guò)程中，熒光信號(hào)被收集，轉(zhuǎn)化為成為擴(kuò)增和熔解曲線。具體數(shù)據(jù)就是基線，熒光閾值和Ct值。
CT值: qPCR擴(kuò)增過(guò)程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的熒光閾值時(shí)的所對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)(Cycle Threshold)。
基線:擴(kuò)增曲線的水平部分(背景信號(hào)過(guò)高，可獨(dú)立設(shè)置)
在PCR早期，擴(kuò)增處于理想情況下，循環(huán)數(shù)較少，產(chǎn)物積累少，產(chǎn)生熒光的水平不能與熒光本底背景明顯地區(qū)別，之后熒光的產(chǎn)生增加進(jìn)入指數(shù)期。
可以在PCR反應(yīng)剛處于指數(shù)期的某一點(diǎn)上來(lái)檢測(cè)PCR產(chǎn)物的量，以此作為“一定產(chǎn)物量”，并且由此來(lái)推斷模板最初的含量。一定產(chǎn)物量對(duì)應(yīng)的熒光信號(hào)強(qiáng)度，也就是熒光閾值。
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